。氮吹仪操 作过程与菌落原位杂交基本相似。氮吹仪硝酸纤维素膜上的菌落裂解后，固 定蛋白质并用相应的抗体检测菌落。 --对筛选出的基因工程菌还需要进行结构分析鉴定。提取基因工程 菌中的质粒，用限制酶切，经凝胶电泳检测插入片段的大小，作物理图 谱。更可靠的方法是作 345的序列分析。 --（五）外源基因的表达 --载体依据功能的不同可分为克隆载体和表达载体两类。克隆载体 以复制基因，增加基因的拷贝数为目的。只需要具备复制子、多克隆位 点和筛选标志。表达载体不仅要复制外源基因，还要表达外源基因。除需具备克隆载体的条件外，还要有 基因表达的调控序列。 --原核细胞中基因表达的调控元件有以下几种： --（F）启动子 -启动子是 345上转录起始位点上游的一段序列，是 M45聚合酶的识别和结合位点（见 第十三章）。原核细胞基因工程采用的强启动子包括色氨酸操纵子启动子， !噬菌体左向和右向启动子， D; 噬菌体的启动子等。 --（7）N3序列 -N3序列是 .M45翻译起始点上游的一段序列，该序列和核糖体小亚基上 FO N "M45 的 PQ端的碱基互补，是核糖体的结合位点（参见第十四章），N3序列和翻译起始点之间的距离影响翻译的 效率。 --（P）终止子 -利用强启动子表达外源基因时，在外源基因的下游必须加入不依赖 !因子的转录终止 图 F; 8-菌落原位杂交 第十七章 ,基因技术#"! 子，以防转录的“通读”并提高质粒的稳定性。终止子是 !"# $%端的一段序列，具有终止转录的功能。终 止子转录出来的 &’"#能形成茎环结构，并紧接着多聚 (，形成转录终止信号。 ,,用于原核细胞基因工程的表达

载体，根据基因表达的蛋白质 是否与细菌蛋白融合型分为非融合蛋白表达载体和融合型蛋白 表达载体。非融合蛋白载体表达的产物，结构和生物学功能都接 近天然产物，缺点是易被细菌蛋白酶降解。融合蛋白载体表达的 蛋白质不被细菌蛋白酶降解，可用针对原核蛋白的亲和层析纯化 融合蛋白。但纯化后还需要采取措施从融合蛋白上切下所需要 的蛋白质或多肽（图 )* +）。 ,,不论是融合型表达载体还是非融合型表达载体，操作时都要 注意不能改变外源基因的开放阅读框架。 ,,大肠杆菌是最常用的基因表达系统，由于缺少转录后的加工 系统和翻译后的加工系统，真核基因在大肠杆菌中转录和翻译后 都不能进行加工，使它的应用受到一定的限制。可选择昆虫细胞 和哺乳动物细胞替代大肠杆菌作为表达系统。哺乳动物细胞作 为表达系统具有如下优点： （)）重组质粒转染的细胞具有遗传的 稳定性和可重复性；（-）哺乳动物细胞能对外源基因转录的 ./’"#剪切加工成成熟的 &’"#；（$）对表达的蛋白质能进行转 录后的加工，如糖基化；（0）可将表达产物分泌到培养基中方便 下游的提纯。 ,,基因工程技术在医药卫生领域中的广泛应用促进了医学的 进步与发展。基因工程疫苗因剔除了致病基因，比传统疫苗安 全，也没有血液制品的潜伏交叉感染的危险。由基因工程技术生 产的生物制剂，如干扰素、白介素、多种细胞生长因子等已经投入 临床使用。基因诊断、基因治疗都离不开基因工程技术。基因工程技术为生命科学和医学研究提供了新 的方法和手段。 第二节 ,分子杂交 ,,分子杂交（&12345267 .897:;:<6=:1/）是基因工程和分子生物学的重要技术之一，也是基因诊断中最常用 的技术。 ,,分子杂交以 !"#的变性和复性为理论基础。 !"#在某些理化因素的作用下碱基对间氢键破坏，由 双链变成单链的过程谓之 !"#变性。变性 !"#的单链重新合成双链的过程为 !"#的复性。分子杂交 是指不同来源的单链核酸通过碱基互补形成杂合双链的过程。其中的一条单链杂交前要进行标记，称为 探针。分子杂交中探针的浓度大于待测核酸的浓度，以保证探针与 !"#充分杂交。 一、核酸探针 ,,核酸探针（>7193）是分子杂交的技术基础，它是一段与被检测的核酸序列互补的带有标记的核苷酸片 段，长度一般为十几到几千个碱基不等。探针标记的方法分为： ,,（一）放射性同位素标记 ,,用于标记核酸探针的同位素主要是

 $-?， $-?标记的探针广泛用于各种滤膜杂交，它的放射活性高，能 释放 !粒子，穿透力强，通过放射自显影，灵敏度高，需要时间短，但它半衰期短，标记的探针最好在一周内 图 )* +,基因工程表达的蛋白质电泳图 "!!第三篇 !遗传信息的传递 使用。 !!（二）光敏生物素标记 !!光敏生物素（"#$%$&’$%’(）是一种光敏化合物，通过一个连接臂，一端连接生物素，另一端连接化学性 质活泼的光敏基团。在强可见光下，光敏基团与核苷酸特定部位共价结合，合成光敏生物素标记探针。 !!（三）地高辛标记物 !!地高辛（)’*$+’*,(’(，-’*）是类固醇半抗原化合物，通过一个 ..个碳原子的交联臂与尿嘧啶核苷酸的 嘧啶环上的第 /位碳相连，形成地高辛标记的尿嘧啶核苷酸。地高辛标记的效率高，一般每 01 20/个核 苷酸（(%）中就带一个地高辛配基，杂交后又有灵敏的免疫酶学检测系统，灵敏度高，有取代生物素标记探 针的趋势。 !!（四）分子信标 !!分子信标（3$4,56478 &,75$(）是根据核酸碱基配对原则和荧光共振能量转移现象设计的。分子信标 长约 0/ (%，空间结构呈茎环形，其中环序列是和靶核酸互补的探针，茎长 / 29 (%，由与靶序列无关的互补